神经电生理学的时间发展遵循遗传程序，类似于发育过程中的细胞成熟和组织。这种电生理发育的特性，即神经振荡，可用于描述大脑发育的特征。本研究利用人类基因组编码的先天程序生成了功能成熟的皮质类器官。简而言之，干细胞通过连续振荡悬浮在培养液中，自然聚集成胚状体，然后暴露在培养基配方中进行神经诱导、分化和成熟。特定的培养形式、培养基成分和暴露于这些培养基的维持的时间区分了类器官方案，并决定了一个方案是否针对特定的神经命运进行引导或非引导。本文介绍的 “半引导 ”方案与大多数引导方案相比，诱导和分化步骤较短，特异性模式化分子较少，但与非引导型方案不同的是，它仍然使用神经营养因子，如脑源性生长因子和神经营养素-3。这种方法产生了非引导方法的细胞类型多样性，同时保持了疾病建模的可重复性。

　　本方案描述了这些类器官的电生理学特征，发现它们再现了在发育中的人脑中观察到的神经振荡的成熟过程。这一方案代表了将分子和细胞生物学与人类认知联系起来的第一步，它已被用于发现人类大脑发育、进化和神经系统疾病的基本特征。有经验的细胞培养技术人员有望用 1 个月的时间完成该方案，包括延长成熟时间、电生理记录和腺相关病毒转导程序。

　　根据国际干细胞研究学会《人类干细胞研究使用标准》的建议，用于生成类器官的 iPSC 母细胞或细胞库应通过成功分化为三个胚层来评估其全能性，以确保基因组完整性。新重编程的 iPSC 在用于定向分化前应至少传代十次，新解冻的 iPSC 在使用前应至少传代两次。应按时进行检查 iPSC 和类器官是否受到支原体污染。此外，在开始实验前应进行功率分析，以确保足够的重复。在为每个新的 iPSC 品系培养第一代类器官时，必须根据经验确定和描述每孔自发形成的类器官的数量、生长速度、最佳 “分裂比 ”以及将生长的类器官重新分配到其他孔的时机。在对照品系和疾病相关 iPSC 品系之间作对比培养时，一定要使用一致的经验确定的分割比例，以防止 “鱼缸 ”效应。这些效应可能是由于在同一时间点，类器官所处的孔中的类器官数量大大多于或少于上一代，因此导致类器官暴露于不同梯度的生长因子。iPSC 的神经化可能因基因型而异；因此，在实验开始前和实验过程中评估每个新 iPSC 系的神经化能力和效率很重要。此外，神经诱导 1 个月后，类器官的直径应为 250-1,000 μm，并含有神经丛。没有神经丛的类器官应丢弃。不同细胞系的类器官平均大小会有差异；应评估平均大小，明显较小和/或较大的类器官应由操作者自行决定丢弃。

　　由于分化方法的性质，类器官世代之间的差异不可避免。研究人员将复制定义为从 iPSC 阶段开始的独立类器官批量生成。由于所需的对照和重复数量将取决于与起始 iPSC 株系相关的可变性、所研究表型的效应大小、所研究疾病的罕见程度以及同意捐献者的数量，因考虑因素。iPSC系不仅在相同基因型的患者之间是可变的，而且在来自相同重编程事件的克隆之间也是可变的。在使用 iPSC 进行疾病建模时，通常倾向于从未受影响的共同生活的亲属（通常是亲本）中提取对照细胞系，以便与受影响的患者细胞系具有相似的遗传背景。同源细胞系可以探索与患者来源的iPSC相关的较少的细胞系变异性的基因突变。由于 scRNAseq 的成本高昂，传统上需要的重复次数较少（有时甚至只需要 1 次重复），但建议增加分析的细胞数量，以更好地捕捉成熟类器官中细胞类型的多样性。研究人员建议用免疫组化、RT-PCR 和其他正交试验验证重要的 scRNAseq 发现，并用功能测定来证实表型表达测定。操作人员应具有组织培养经验，掌握良好的无菌技术，并在类器官生成前具有处理 iPSC 或人类胚胎干细胞的经验。

　　程序 2：微电极阵列（MEA）。本方案介绍了使用Axion生物系统在MEA平板上进行电镀的操作规程。不过，从类器官获取电功能数据的其他平台和方法也是存在的，能够准确的通过项目组的需要进行探索。对于所有这些系统来说，MEA 板都是由透明或玻璃孔成的，可以用普通的倒置显微镜观察培养物跟着时间的变化。虽然这些多孔格式，无论平台如何，都能为表征、检测和药物筛选提供更高通量的格式，但它们往往缺乏足够的电极来覆盖整个孔，因此就需要在电镀时仔细放置类器官，并优化培养条件，以促进神经元细胞的生长，以覆盖电极阵列。未来有极大几率会出现新兴的 MEA 技术，这些系统将提供更高的空间分辨率，并允许检查复杂的神经元网络相互作用，以低通量为代价。这些多孔 MEA 格式的一个共同限制是，需要对类器官进行电镀，在这种贴壁镀膜格式中长期培养类器官可能会改变类器官的细胞结构。

　　程序 3：钙成像。除了使用 MEA 系统评估电活动外，还有一种替代方法就是合成钙指示剂染色和成像。在许多应用中，光学成像比直接记录电活动更具优势。Ca2+成像能以精确的空间分辨率同时观察网络中的多个神经元，而且光学报告的放电率估计值与细胞内记录的放电率估计值更一致。因此，钙指标能更准确地揭示网络和神经元内部的时空活动模式。与 MEA 和其他直接记录方法相比，钙成像检测更容易获得，成本更低，操作更简单。有必要注意一下的是，皮质类器官可以在不同的 MEA 和钙成像板上做多元化的分析，也可以在同一 MEA 底物上一起进行分析，以便更详细地分析网络和细胞动态。然而，虽然钙成像和MEA记录可以在同一个MEA板上进行，但使用Axion Biosystems Maestro Pro却不能同时进行这些记录。更多的模块化 MEA 系统，将允许在同一基板上同时进行高分辨率显微钙成像和电记录，从而提供更全面的网络动态概览。

　　因此，Axion MEA 系统和使用合成染料的钙成像技术可用于测量从类器官表面迁移到平板上的神经元的整体和单细胞电活动。但无法评估类器官内部神经元的电活动。互补金属氧化物半导体（CMOS）柄探针通常用于体内实验，有可能用于类器官内的测量，但目前在技术上具有挑战性，而且没有针对类器官进行很好的优化。

　　程序4：皮质类器官的AAV转导。腺相关病毒（AAV）曾被用于转导类器官。由于 AAV 与慢病毒转导相比具有优势，本研究提供了 AAV 转导大脑皮层类器官的方向，并进一步应用该工具在类器官神经元中整合稳定的光学电报告。与慢病毒载体不同，AAV 转导的遗传物质不会整合到宿主基因组中，从而避免了宿主细胞中的突变和致癌事件。不过，AAV 载体转导的转基因可以作为外显子保留在宿主细胞中，表达数年之久，同时具有复制缺陷。此外，与慢病毒载体相比，AAV 载体可以选择靶向特定的细胞类型和组织，这使其成为一种候选基因疗法和有效且毒性较低的基因转移载体。

　　首先，在96孔板和6孔板中使用编码GFP报告基因（AAV7m8-GFP）和非编码序列（AAV7m8-null）的AAV7m8载体作为阴性对照，确定了在皮质类器官中成功表达转基因的适当剂量。然后，在确定了适当的载体剂量后，在 6 孔板中用 AAV7m8-GCaMP 载体转导45天龄的皮质类器官。GCaMP的表达在整个类器官中均可见，并随时间持续存在，在2个月大的类器官中表现得最为明显。表达 GCaMP 的细胞也显示出钙活性，表明有可能在皮质类器官中靶向和长期记录钙活性。基因编码的钙离子（Ca2+）指示剂能在特定细胞类型或亚细胞位置有针对性地表达光学报告，从而对神经元亚群进行选择性采样。此外，基因编码传感器可以稳定表达，以研究神经元动态如何随时间演变

　　在 EB 聚合和神经诱导后 1 个月，一个 6 cm厚的 iPSC 平板通常会产生至少 500 个直径约 0.5-1 MM的类器官。类器官应呈现相对球形的形态，没有明显的突起或附属物。3-5周大的类器官在共聚焦显微镜下应表现出 “斑点状 ”的环形变色，表明有神经丛。较老的类器官应大部分呈暗色。如果通过免疫组化成像，随着时间的推移，类器官应表现出由表达 Ki67 和 nestin 的中央增殖区、皮质下层（TBR1 和 CTIP2）和上层（CUX1 和 SATB2）皮质神经元、胶质细胞（GFAP）和 GABA 能（CR）神经元组成的神经丛（图 1）。

　　图1 皮质类器官的生成概述及其特征。a，生成皮质类器官的程序示意图。比例尺，1 cm。b，脑类器官与神经球的比较示意图，图中有神经丛以及显示增殖细胞（SOX2）、中间祖细胞（TBR2）、下层（CTIP2）和上层（SATB2）皮质神经元的代表性免疫染色。比例尺， 50 μm。c，代表性免疫染色显示细胞核（DAPI）、β-catenin（（β-cat）稳定在莲座内腔）、增殖的神经祖细胞（NPCs）（Ki67 和 Nestin）、神经元（NeuN）、皮质下层神经元（TBR1 和 CTIP2）、皮质上层神经元（SATB2）、中间神经元（CR）和神经胶质细胞（GFAP）。比例尺， 50 μm。d，scRNAseq（每个文库预处理约 12,000 个细胞）中祖细胞、中间祖细胞（IP）、胶质细胞、谷氨酸能神经元和 GABA 能神经元在各个时间点的比例，以柱状图表示。e，发育过程中类器官的预期尺寸：诱导期约 200 μm，增殖期 375 μm，成熟期 500 μm。诱导期约为第 5 天，增殖期约为第 18 天，成熟期约为第 28 天。f，4个月大的类器官突触超微结构电镜图(蓝色)。比例尺， 200 nm。g，在 4 个月大的神经元中使用 SYN:EGFP 报告器观察到的锥体神经元和树突结构的代表性图像。比例尺，5 μm。h，对 10 个月大的皮质类器官进行 GABA 能神经元标记物小白蛋白(PV)和生长抑素(SST)的免疫染色。比例尺，50 μm。

　　当类器官在完全的 BrainPhys 培养基中培养 2.5-3 个月大时，在 MEA 板上培养的类器官应该可以观察到可测量的自发神经峰值。随着时间的推移，自发神经峰值将协调成可测量的自发脉冲。峰值和脉冲活动会随着类器官年龄的增长而出现并增加。相对于适当的对照 iPSC 衍生的类器官，某些疾病基因型 iPSC 衍生的类器官中峰值和脉冲的出现、频率、模式和发展随时间的变化可能是可观察和可测量的。小分子、药物化合物或毒素暴露的影响可能会调节电活动，可通过处理前后的 MEA 记录进行测量。Axion Biosystems Maestro Pro可通过两种滤波器进行电记录：神经高频宽带（100-400 hz）和LFP低通/带通（0-4 hz）。使用神经滤波器进行记录可捕捉和量化神经峰值和脉冲。同时使用神经滤波器和 LFP 滤波器进行记录，可以捕获并量化类器官在较晚时间点出现的振荡波，具体方法是使用 “程序 2：步骤 21 ”中的自定义 MEA 分析代码。LFP 在约 6 个月时出现，同时伴有功能性抑制性中间神经元的发育和 GABA 在 6 个月时的释放。这表明神经元之间交流的复杂性增加，与二维模型相比成熟度提高。为了探索这些 LFP 的发育过程，早产新生儿的脑电图特征（振荡时间、振荡间隔时间、振荡电压等）被用于一种定制的无偏机器学习方法，以开发一个正则化回归模型，根据新生儿的脑电图特征预测其发育 “年龄”。然后将该模型应用于类似的 MEA LFP 指标，以预测类器官和其他神经模型的发育年龄。由此可见，老年类器官（25 周大）表现出的机器学习预测年龄与新生儿大脑神经发育的年龄非常吻合。值得注意的是，这种预测年龄与新生儿实际年龄之间的高度相关性只在这种人类类器官模型中得到了重现，而在小鼠、二维或其他三维模型中却没有（图2）。

　　图2 电生理学概述和表征。a，类器官在MEA板上的电镀图。比例尺，1 mm。b，类器官电生理信号处理流程示意图。神经元迹/峰的代表性波形。原始MEA数据分别作为种群峰值和LFP做多元化的分析。黄色高亮表示同步网络事件。c，与二维神经元相比，皮质类器官平均放电率升高且持续增加(类器官培养n = 8，二维神经元n = 12±sd)。插图：在分化的12周(从8周到20周)中，成对培养物之间的放电率矢量相关性显示类器官复制之间的变异性降低±s.d.。d，皮层类器官发育过程中网络事件期间LFP和种群(流行)峰值的时间序列。每个覆盖的跟踪表示同一记录会话期间的单个事件。e，模型预测的发育时间（y 轴，年龄（周））与类器官（橙色和蓝色）的实际培养周数（x 轴）以及黑色早产新生儿数据点的真实年龄一致。虚线代表统一，表示完美的预测。实线上的大圆圈和阴影区域分别表示预测的平均值±s.d.，点表示每个样本的预测值(所有时间点的类器官n = 8)。f，类器官和对照数据集的实际和预测发育时间之间的Pearson相关系数，包括早产新生儿数据、小鼠原代培养(PC)、2D iPSC培养和人胎儿大脑培养。正相关表明模型有能力捕捉发展轨迹。

　　类器官可移植到 Axion Biosystems 的 MEA 板和玻璃底成像板上，对网络和单细胞水平的活动进行平行分析。在粘附和生长之后，类器官会形成密集的神经元网络和成熟的神经元，这些神经元可以很容易地用常用的合成钙指示剂染色，并用传统的外荧光显微镜成像。有趣的是，使用合成染料进行的钙离子成像显示，与二维培养的离体人类神经元相比，从类器官和相邻类器官迁移的神经元显示出更复杂的Ca2+模式。来自类器官的神经元的单细胞钙峰事件显示出延伸至整个 FOV 的强烈钙活动闪烁，显示出在二维离体神经元中观察不到的同步水平。这与 MEA 的结果一致，证明了复杂网络构型的自发形成，从而在相互连接的类器官中产生高度同步的活动（图3）。

　　图3 皮质类器官钙成像概述和AAV7m8-GCaMP转导表征。a，用于类器官单光子钙成像的光学装置，包括激发(EX)、发射(EM)和分色镜（DM）规格示例。b，成像板上MAP-2染色的皮质类器官及其相互连接网络的代表性图像。比例尺，1000 μm。c，在两个有代表性的 FOV 中记录的钙离子轨迹，显示高度同步的钙离子活动与单个峰值交替出现。比例尺，250 μm。d，用 AAV7m8 和 GFP 及 GCaMP 倒置末端重复 (ITR) 序列载体转导皮质类器官的实验设计。CMV，巨细胞病毒。e，用AAV7m8-GFP和AAV-null在96孔板上以1 × 1010 vg /孔分别转导后第5天和第9天的离体皮质类器官的代表性图像。比例尺，1000 μm。重复数：AAV-null = 2, AAV7m8-GFP = 4。f，AAV7m8-GFP转导后第5天和第9天在6孔板上以每孔1 × 1010 vg转导的皮质类器官的代表性图像。比例尺，1000 μm。g，皮质类器官的代表性图像，分别显示GCaMP传感器在转导后第2、7、15和21天的神经元表达。比例尺，1000 μm。h, 2个月大的表达GCaMP传感器的类器官的代表性共聚焦图像(绿色)，具有物理分离的核定位的dTomato荧光团(红色)。比例尺，50 μm。

　　关于本研究中实验操作的74项具体步骤，小学社将在下期推文中为大家详细讲解！

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